Флуоресцентный фильтр является важным компонентом флуоресцентного микроскопа. Типичная система имеет три основных фильтра: фильтр возбуждения, фильтр излучения и дихроичное зеркало. Обычно их упаковывают в куб, чтобы группу можно было вставить в микроскоп вместе.
Как работает флуоресцентный фильтр?
Фильтр возбуждения
Фильтры возбуждения пропускают свет определенной длины волны и блокируют волны другой длины. Их можно использовать для получения разных цветов, настроив фильтр так, чтобы он пропускал только один цвет. Фильтры возбуждения бывают двух основных типов — длиннопропускные фильтры и полосовые фильтры. Возбудитель обычно представляет собой полосовой фильтр, который пропускает только волны, поглощаемые флуорофором, тем самым сводя к минимуму возбуждение других источников флуоресценции и блокируя возбуждающий свет в полосе излучения флуоресценции. Как показано синей линией на рисунке, ВР составляет 460-495, что означает, что он может проходить только флуоресценцию 460-495 нм.
Он размещается на пути освещения флуоресцентного микроскопа и фильтрует все длины волн источника света, за исключением диапазона возбуждения флуорофора. Минимальное пропускание фильтра диктует яркость и яркость изображения. Для любого фильтра возбуждения рекомендуется передача минимум 40 %, в идеале передача должна быть >85 %. Полоса пропускания фильтра возбуждения должна полностью находиться в диапазоне возбуждения флуорофора, чтобы центральная длина волны (CWL) фильтра была как можно ближе к пиковой длине волны возбуждения флуорофора. Оптическая плотность (OD) фильтра возбуждения определяет темноту фонового изображения; OD является мерой того, насколько хорошо фильтр блокирует длины волн за пределами диапазона передачи или полосы пропускания. Рекомендуется минимальный ОП 3,0, но идеальным является ОП 6,0 или выше.
Фильтр выбросов
Эмиссионные фильтры служат для того, чтобы обеспечить попадание желаемой флуоресценции образца на детектор. Они блокируют более короткие волны и имеют высокую пропускную способность для более длинных волн. Тип фильтра также связан с номером, например BA510IF на рисунке (фильтр с помехозащитным барьером), это обозначение относится к длине волны при 50 % от максимального пропускания.
Те же рекомендации для фильтров возбуждения справедливы и для фильтров выбросов: минимальная передача, полоса пропускания, OD и CWL. Эмиссионный фильтр с идеальной комбинацией CWL, минимального пропускания и OD обеспечивает максимально яркие изображения с максимально глубокой блокировкой и гарантирует обнаружение самых слабых сигналов излучения.
Дихроичное зеркало
Дихроичное зеркало размещается между фильтром возбуждения и фильтром излучения под углом 45° и отражает сигнал возбуждения в сторону флуорофора, одновременно передавая сигнал излучения в сторону детектора. Идеальные дихроичные фильтры и светоделители имеют резкие переходы между максимальным отражением и максимальным пропусканием, при этом отражение >95% для полосы пропускания фильтра возбуждения и пропускание >90% для полосы пропускания эмиссионного фильтра. Выберите фильтр с учетом длины волны пересечения (λ) флуорофора, чтобы минимизировать рассеянный свет и максимизировать соотношение сигнал/шум флуоресцентного изображения.
Дихроичное зеркало на этом рисунке — DM505, названное так потому, что 505 нанометров — это длина волны при 50 % максимального пропускания этого зеркала. Кривая пропускания для этого зеркала показывает высокое пропускание выше 505 нм, резкое падение пропускания слева от 505 нанометров и максимальную отражательную способность слева от 505 нанометров, но все же может иметься некоторое пропускание ниже 505 нм.
В чем разница между длиннопропускающими и полосовыми фильтрами?
Флуоресцентные фильтры можно разделить на два типа: длиннопропускные (LP) и полосовые (BP).
Длиннопроходные фильтры пропускают длинные волны и блокируют более короткие. Длина волны ограничения — это значение, составляющее 50 % от пиковой передачи, а все длины волн выше этой границы передаются длиннопроходными фильтрами. Они часто используются в дихроичных зеркалах и эмиссионных фильтрах. Длиннопроходные фильтры следует использовать, когда приложение требует максимального сбора выбросов и когда спектральная дискриминация нежелательна или необходима, что обычно имеет место для зондов, которые генерируют один излучающий компонент в образцах с относительно низким уровнем фоновой автофлуоресценции.
Полосовые фильтры пропускают только определенный диапазон длин волн и блокируют другие. Они уменьшают перекрестные помехи, позволяя передавать только самую сильную часть спектра излучения флуорофора, уменьшают шум автофлуоресценции и, таким образом, улучшают соотношение сигнал/шум в образцах автофлуоресценции с высоким фоном, чего не могут обеспечить фильтры с длинным проходом.
Сколько типов наборов флуоресцентных фильтров может поставить компания BestScope?
Некоторые распространенные типы фильтров включают синие, зеленые и ультрафиолетовые фильтры. Как показано в таблице.
| Набор фильтров | Фильтр возбуждения | Дихроичное зеркало | Барьерный фильтр | Светодиодная лампа Длина волны | Приложение |
| B | БП460-495 | ДМ505 | ВА510 | 485 нм | ·FITC: метод флуоресцентных антител ·Ацидиновый апельсин: ДНК, РНК · Аурамин: Туберкулёзная палочка. ·EGFP, S657, РСГФП |
| G | БП510-550 | 570 немецких марок | ВА575 | 535 нм | ·Родамин, TRITC: метод флуоресцентных антител. · Йодид пропидия: ДНК ·Запрос предложений |
| U | БП330-385 | ДМ410 | ВА420 | 365 нм | ·Автофлуоресцентное наблюдение ·DAPI: окрашивание ДНК ·Hoechest 332528, 33342: используется для окрашивания хромосом. |
| V | БП400-410 | ДМ455 | ВА460 | 405 нм | ·Катехоламины ·5-гидрокситриптамин ·Тетрациклин: скелет, зубы |
| R | БП620-650 | ДМ660 | БА670-750 | 640 нм | ·Су5 ·Алекса Флюор 633, Алекса Флюор 647 |
Наборы фильтров, используемые при регистрации флуоресценции, разработаны с учетом основных длин волн, используемых в приложениях флуоресценции, и основаны на наиболее часто используемых флуорофорах. По этой причине их также называют в честь флуорофора, для которого они предназначены, например, фильтрующие кубы DAPI (синий), FITC (зеленый) или TRITC (красный).
| Набор фильтров | Фильтр возбуждения | Дихроичное зеркало | Барьерный фильтр | Светодиодная лампа Длина волны |
| ФИТЦ | БП460-495 | ДМ505 | БА510-550 | 485 нм |
| ДАПИ | БП360-390 | ДМ415 | БА435-485 | 365 нм |
| ТРИТЦ | БП528-553 | ДМ565 | БА578-633 | 535 нм |
| FL-Аурамин | БП470 | 480 немецких марок | ВА485 | 450 нм |
| Техасский красный | БП540-580 | 595 немецких марок | БА600-660 | 560 нм |
| мЧерри | БП542-582 | ДМ593 | БА605-675 | 560 нм |
Как выбрать флуоресцентный фильтр?
1. Принцип выбора флуоресцентного фильтра заключается в том, чтобы позволить свету флуоресценции/эмиссии проходить через часть изображения, насколько это возможно, и в то же время полностью блокировать возбуждающий свет, чтобы получить максимальное соотношение сигнал/шум. Особенно при применении микроскопа с многофотонным возбуждением и полным внутренним отражением слабый шум также будет сильно влиять на эффект визуализации, поэтому требования к соотношению сигнал/шум выше.
2. Знать спектр возбуждения и излучения флуорофора. Чтобы создать набор фильтров флуоресценции, который генерирует высококачественное высококонтрастное изображение на черном фоне, фильтры возбуждения и излучения должны обеспечить высокую передачу с минимальной пульсацией полосы пропускания в областях, которые соответствуют пикам возбуждения или эмиссии флуорофора.
3. Учитывайте долговечность флуоресцентных фильтров. Эти фильтры должны быть невосприимчивы к интенсивным источникам света, генерирующим ультрафиолетовый (УФ) свет, который может привести к «выгоранию», особенно фильтра возбудителя, поскольку он подвергается воздействию полной интенсивности источника освещения.
Изображения различных флуоресцентных образцов
Ресурсы собираются и систематизируются в Интернете и используются только для обучения и общения. Если есть какие-либо нарушения, пожалуйста, свяжитесь с нами, чтобы удалить.
Время публикации: 9 декабря 2022 г.